تعيين جنسيت در پرندگان.ارائه:شهین شبرندی . استاد:دکتر محمودی

تعيين جنسيت در پرندگان
جنس تمام پرندگان از جمله شتر مرغ( ازگونه سينه پهن) به وسيله کرمزومهاي جنسي معين مي گردد . پرندگان نر داراي دو کرمزوم جنسي خاص خود هستند که Z ناميده مي شود . ( ZZ ) ماده ها داراي يک کرمزوم Z و يک کرمزوم W مي باشند . (ZW ) هنگامي که پرنده نر اسپرم توليد مي کند يک کرمزوم Z در اسپرم قرار مي گيرد . اما نقش ماده در هنگام توليد تخم متفاوت است . اگر کرومزوم W در تخم قرار گيرد جنيني که به وجود مي آيد ( ZW ) ماده خواهد بود . در صورتي که تخم داراي کرمزوم Z باشد ، جنين ( ZZ) نر خواهد بود . در مورد شتر مرغها و تقريباً همه پرندگان بر عکس انسان ، کرمزومهاي ماده تعين کننده جنس فرزندان مي باشد .
ژن (DMRT1 ) در پرنده ی سینه پهن ، نقش آن در تعیین جنسیت در پرندگان
خلاصه : بر خلاف پستانداران، پرندگان نر دارای کروموزوم zz و جنس مادهZW می باشند در بیشتر پرندگان کروموزوم z بزرگ و غنی است در حالیکه کروموزوم w کوچک و هتروکروماتینی است . هر ژن متمایز در سینه پهن zو w هستند بنابراین داوطلب قوی برای تعیین جنسیت هستند ، بخش داوطلب تعیین جنسیت در پرندگان ژن1 DMRTدر شتر مرغ استرالیایی (یکی از گونه های پرنده ی سینه پهن) می باشدکه درطول مراحل تمایز غده جنسی در جوجه بیان شده ، برطبق نقشه های ژني این ژن 1DMRT در ناحیه ديستال بازوی کوتاه Z وجود دارد و درروی کروموزوم W دیده نمی شود0 بطور غیره منتظره ،ترادف و توالی ژن DMRT1 شترمرغ استرالیایی 88 درصد همسانی دارد با توا لی DMRT1 موجود در جوجه و 65/0 هم همسانی با توالی ژن 1 DMRT موجود درانسان دارد ، یک ناحیهbp 270 جفت باز بیان نشده در اینترون3 ژن DMRT1شترمرغ استرالیایی که 90/ 0که همسان باتوالی وترتیب در اینترون مربوط به ژن DMRT1در انسان ،این حفاظت فوق العاده بالادرحدود300 میلیون سال از تکامل ، حاکی از یک تابع مهم است در کنترل بیان ژن DMRT1 و تعیین جنسیت درمهره داران 0
ژن DMRTبرای اولین بار در تعیین جنسیت مهره داران دخیل بود که این ژن توسط شناسایی در کروموزوم شماره9 انسان ، این ژن کد می کند پیام را که حاوی پروتئین می باشد که درتعیین جنسیت دخیل می باشد0
درموش خانگی ژن DMRT1 بطور وسیع درستیغ تناسلی هردوجنسxxوxy بیان می شود که درجنس نر درطی
گونادوژنردرلوله های منی ساز بیضه و سلولهای سرتولي دیده شده است وهمچنین درسلولهای بنیادین این ژن وجود دارد 0
پرندگان سیستم تعیین کننده ی کروموزوم جنسی دارند که درپرندگان نر zz ودرپرندگان ماده zw است کروموزوم شماره 9انسان باکروموزوم z درجوجه همسان است ،که ژن DMRT درانسان برروی كروموزوم شماره 9انسان می باشد ودرپرندگان برروی كروموزمZ می باشد ودركروموزم w درپرندگان وجودندارد0
واکنش RT-PCR که شامل CDNAوپرایمرهای DMEX3F1، DMTNE1، DMTNF2،DMTNR1، DMEX4R1 و همچنین dctp،dATP،dTTP و DNAپلیمراز دراین آزمایش (RT-PCR)PCRژن DMRT1 بیان شده در مرزتناسلی متمایز غده جنسی رانشان داده است0 تفاوت در بیان ژن DMRT1 باعث بوجود آمدن دوجنس نر و ماده می شود شکل(3) موقعیت پرایمرهای RT- PCR دراگزون DMRT1 و قطعه اینترون حفاظت شده،اگزون 4 رانشان می دهد.اینترون 3 حفظ شده ناحیه اي مسئول برای تنظیم فعالیت ژن DMRT1 می باشد و یک نقش مهم آن درتنظیم دوزژن تولیدی درپرندگان و بنابراین درتنظیم معیین جنسیت می باشد سینه پهن بزرگ وپرنده ای بدون پرواز است که در میان گونه های آن می توان شترمرغ آفریقایی و شترمرغ استرالیایی رانام برد آنها دارای کرو موزوم z که ازاندازه یکسان با کروموزوم موجه است وکارپوتیپ كروموزوم نشان می دهد که دو کروموزوم جنسی ازنظرتمام طول مشابه اند،برخلاف بخش هتروکروماتیني کروموزوم کوچکw درجوجه ،کروموزوم w شترمرغ استرالیایی بزرگ و جفت با z در بالاترین طول،کارپوتیپ کروموزومی z- DNA جوجه موید آن است کهZ شتر مرغ استرالیایی وWهمسان هستند اما ناحیه ای ویژه ی کوچک درWنزدیک سانترومراست که ماپیش بینی کردیم که این ناحیه ویژه درماده نشان دهنده ی تمایز ابتدايي zw رادرپرندگان مي باشد
بحث:
ما نتیجه می گیریم که ژن DMRT1 روی کروموزوم Z شترمرغ استرالیایی وجود دارد وکپی درکروموزوم W وجود ندارد و همچنین کشف کردیم توالی و ترادف حفاظت شده دردرون اینترون 3 ژن DMRT1 که این توالی اینترون 3 مسئول تنظیم بیان ژن DMRT1 می باشد 0
همسانی کروموزوم 9 انسان باکروموزوم Z جوجه موید این نکته است که ژن DMRT1 یک ژن حیاتی برای تعیین جنسیت درپرندگان می باشد و بیان DMRT1 درطي گنادوژنزدرجنین جوجه با این فرضیه مطاقبت دارد برطبق مشاهده ی نقشه های ژن DMRT1 درکروموزوم Z وعدم وجودآن برروی کروموزوم w درانسان دو نسخه ژن DMRT وجود دارد که برای تعیین بیضه ها لازم می باشند درکروموزوم ZZ پرنده نرژن DMRT1 فقط ازجمله هزاران ژن هایی است که روی کروموزوم Z وجود دارد که نظیر و همانند آن روی کروموزوم هتروکروماتینی کوچک w وجودندارد ودرصورت نبودن جهش وانتقال ژني ، ژن DMRT1درتعیین جنسیت پرندگان نقش دارد .
تعيين جنسيت ژنتيكي در شترمرغ
تعين جنسيت از طريق دي ان آ در شتر مرغها فقط نيازمند يک قطره خون است که از آن يک نمونه DNA استخراج مي شود . پس از طي چندين فرآيند شيميايي ، يک بر چسب راديو اکتيو ( به نام پروب 10 ) به زنجيره DNA چسبانده مي شود . که به دنبال بندهاي DNA در کرمزومهاي جنسي گشته و به آن مي چسبد . پروب نوع کرومزوم هاي جنسي ZZ يا ZW ( يعني نر يا ماده بودن پرنده را تعيين مي کند.يکي از بهترين جنبه هاي تعيين جنسيت از طريق DNA دقت بالاي آن است ( 99 درصد .)
تعيين جنسيت قناري با استفاده از روش PCR
چکيده: تعيين جنسيت اغلب پرندگان تا زمان بلوغ و حتي گاهي بعد از بلوغ امري نسبتا مشکل است. اما جنسيت پرندگان و ساير جانوران از بدو تشکيل نطفه، به لحاظ ژنتيکي معين است. امروزه با پيشرفت روش هاي مولکولي، تعيين جنسيت جانداران در هر مرحله از زندگي ميسر مي باشد. در تحقيق حاظر تعيين جنسيت در قناري با استفاده از واکنش PCR و براساس دو ژن CHD-W و CHD-Z شرح داده شده است. در اين تحقيق جمعا از 29 قطعه قناري استفاده شد. استخراج DNA از انتهاي کالاموس پر قناري هاي زنده صورت پذيرفت و با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي طراحي شده در اين طرح، واکنش PCR تنظيم گرديد. نتايج نشان دهنده تکثير دو قطعه DNA به طول هاي 345 و 306 جفت باز براي جنس ماده و فقط يک باند 306 جفت باز براي جنس نر بود. اين نتايج براي كليه نمونه هاي پر مشاهده شد. از آنجا که طراحي اين سيستم تعيين جنسيت براي اولين بار در قناري مورد استفاده قرار مي گيرد و نتايج مولکولي با ويژگي هاي مورفولوژيک دو جنس نر و ماده کاملا مطابقت دارد، لذا تعيين جنسيت جوجه هاي قناري با انجام واكنش PCR روي نمونه هاي پر، آسان، سريع، بي خطر و ارزان مي باشد.




DMRT1 in a ratite bird: evidence for a role in sex determination and discovery of a putative regulatory element



Abstract.
Unlike mammals, birds have a ZZ male/ZW female sex-determining system. In most birds, the Z is large and gene rich, whereas the W is small and heterochromatic, but the ancient group of ratite birds are characterized by sex chromo­somes that are virtually homomorphic. Any gene differentially present on the ratite Z and W is therefore a strong candidate for a sex-determining role.
on the emu W chromosome are shared with the Z, the Z­specific location constitutes strong evidence that differential dosage of DMRT1 is involved in sex determination in all birds. The sequence of emuDMRT1 has 88 % homology with chicken DMRTl and 65% with human DMRTl.
Unexpectedly, an unexpressed 270-bp region in intron 3 of emu DMRT1 showed 90% homology with a sequence in the corresponding intron of human DMRTl. This extraordinarily high conservation across 300 million years of evolution suggests an important function, perhaps involved in control of DMRT1 expression and verte­brate sex determination.

In mouse, Dmrtl is expressed exclusively in the genital ridge of both XX and XY embryos, but as gonadogenesis proceeds, it becomes sex-spe­cific and restricted to the seminiferous tubules of the testis, present in both Sertoli and germ cells (Raymond et ai., 1999b, Smith et ai., 1999, De Grandi et ai., 2000). A role in mammali­an sex differentiation is confirmed by the observation that knocking out the proximal promotor and first exon (containing the DM domain) of the mouse Dmrtl gene produced XY mice with defective testis development.
Birds have a chromosomal sex-determining system in which ZZ birds are male and ZW birds are female. It has not been clear whether the W contains a female-determining gene or the Z contains a gene that operates via differential dosage, or both. Because human chromosome 9 is syntenic with the chicken Z chromosome,


lnation. Consistent with this hypothesis, a DMRTl homologue lies on the Z chromosome and is absent from the W in chickens (Nanda et ai., 1999). Experiments using reverse transcriptase PCR (RT-PCR) show that DMRTl is expressed in the genital ridge prior to gonadal differentiation and that male embryos express higher levels of DMRTl than female embryos (Ray­mond et ai., 1999b, Smith et al., 1999).
Although the location ofDMRTl on the Z chromosome and its absence from the small heterochromatic W in chickens is consistent with a role in sex determination, it is only one of thousands of genes specific to the Z chromosome. A better test of sex-determining potential of DMRT1would therefore be to clone and map the homologue of this gene to the nearly homo­morphic sex chromosomes of ratite birds.

linked in birds and, therefore, a candidate for bird sex determination
We therefore cloned and characterised DMRT1 from the emu (Dromaius novaehollandeae). This gene mapped to the Z chromosome but not to the W. This supports the hypothesis that DMRTl is the sex-determining gene in birds. Unexpected­ly, a non-expressed sequence was discovered in an intron that was highly conserved between the emu and human genomes, suggesting an important regulatory role.

RT-PCR reactions consisted of 0.2-ul volumes of template single­stranded cDNA; 100 ng of each primer; 0.2 mM each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP; 2.5 U Taql DNA polymerase (Boehringer Mannheim); and 1110 volume of Taq polymerase buffer (Boehringer Mannheim). PCR reactions were carried out in a Perkin-Elmer 9600 thermocycler under condi­tions chosen according to the annealing temperature of the primers used and the expected size of the product. Control PCRs were performed with water in place of template, as well as using the original sample as template, to test for contaminating DNA.
Primers
Primers used in the RT-PCR experiments involving DMRTl were
designed using the program OLIGO. The sequence of each primer was as follows: DMEX3FI: GAC TCC ACC TAC TAC AGC AG; DMINFI: TIT CCG ATA CTG CTG ATA GG; DMINF2: TTC CGA TAC TGC TGA TAG GG; DMINF3: ACA TAC CCT TCA CAC TAC AG; DMINRI: CTA TCA GCA GTA TCG GAA AA; and DMEX4RI: AAG AAG CGG GTG GGT AGT AG.




Table 1. Percent homology at the nucleotide and amino acid level between emu DMR Tl sequences and chicken and human DMR T I



Discussion
We conclude from these studies that a homologue of DMRTl lies on the Z chromosome in the emu, but there is no copy on the W. Unexpectedly, we discovered a highly con­served sequence lying within intron 3 of the DMRTI gene.the homology of human chromosome 9 with the chicken Z chromosome immediately suggested that this gene is critical for sex determination in birds. The expression ofDMRT1 during gonadogenesis in the chicken embryo is consistent with this hypothesis
If the conserved intron 3 region is responsible for regulating the activity of the DMRTl gene, it may have an important role in regulating the dosage of gene product in birds, and, therefore, in the regulation of sex determination. The difference in DMRT1 expression between males and females approaches the 2:1 ratio predicted by gene dosage. Methylation of the DMRTl locus in females regulated by a locus on the W may protect this locus from dosage compensation (Teranishi et aI., 2001). The conserved sequence within DMRT1 intron 3 may mediate this control.