چگونه سلول های درحال درون خزیدگی به محض ورود به جنین آگاهی می یابندبه کجا بروند؟در سمندرها،که پیش ساز های مزودرمی در حال درون خزیدگی برروی شبکه فیبرونکتین ترشح شده از سلول های سقف بلاستوسل به طرف قطب حیوانی مهاجرت می کنند.کمی قبل از گاسترولاسیون ،اکتودرم فرضی سقف بلاستوسل نوعی ماتریکس برون سلولی را ترشح می کنندکه حاوی فیبریل هایی از فیبرونکتین است. به نظر می رسد مزودرم در حال درون خزیدگی در طول این فیبریل های فیبرونکتین حرکت می کند . Boucat و همکارانش مقادیر زیادی از یک پپتید کوچک شامل توالی آسپارزین ،گلیسین ،آرژنین را به بلاستولا های جنین سمندر کمی قبل از گاسترولاسیون تزریق کردند. اگر فیبرونکتین برای مهاجرت سلول ضروری باشد، پس سلولها به جای اتصال به فیبرونکتین حقیقی برون سلولی به این قطعه پپتیدی محلول متصل می شوند و باید مهاجرتشان موقف شود. همچنین ناتوانی سلول های مزودرمی در یافتن مسیرشان درون خزیدگی را متوقف می کند و این دقیقا چیزی است که اتفاق افتاد. هیچ سلول در حال مهاجرتی در زیر اکتودرم جنین آزمایشگاهی مشاهده نشد. درعوض پیش ساز های مزودرمی در بیرون جنین ها باقی مانده و تشکیل توده ی سلولی به هم پیچیده ای را داده اند ودیگر پپتید های سنتز شده ( شامل قطعات مولکول فیبرونکتین ) مانع مهاجرت نمی شوند. عقیده بر این است که سلول های مزودرمی از طریق پروتئین انتگرین 1βv به فیبرونکتین می چسبد. همچنین مهاجرت های سلول مزودرمی را می توان با تزریق آنتی بادی هایی علیه فیبرونکتین یا زیر واحد v انتگرین که به عنوان قسمتی از گیرنده ی فیبرونکتین عمل می کند، متوقف کرد. Alfandri و همکارانش در سال 1995 نشان دادند که زیر واحد v انتگرین درست قبل از گاسترولاسیون بر روی سلول های مزودرمی ظاهر شده، در سراسر گاسترولاسیون روی سطح آن باقی می ماند و زمانی که گاسترولاسیون پایان می یابد ناپدید می شود. بنابراین به نظر می رسد که سنتز گیرنده های فیبرونکتین شاید پیامی برای زمان شروع، ادامه و توقف مهاجرت مزودرم باشد. به علاوه با نادیده در نظر گرفتن سلول های مزودرمی، ماده ی زمینه ای برون سلولی حاوی فیبرونکتین هم بستری برای چسبندگی و هم مسیری برای جهت دهی مهاجرت سلولی فراهم می کند. Shi و همکارانش در سال 1989 نشان دادند که اگر شبکه های فیبرونکتین اضافی در مسیر سلول های IMZ سمندر قرار داده شوند، این سلول ها به جهت نادرستی مهاجرت می کنند. گسترش همگرا، سلول های در حال مهاجرت را به بالا و به سمت قطب حیوانی می کشاند. به نظر می رسد فیبرونکتین ها مرز این محل را مشخص می کنند فیبریل های فیبرونکتینی برای پهن شدن سلول های مزودرمی سری و گسترش زواید تیغه مانند برای فرآیند مهاجرت لازم می باشند. این فیبریل های فیبرونکتینی در هیبرید هایی که از ادامه ی زندگی عاجز هستند مهم می باشد. Delarue و همکارانش نشان دادند که از بقای هیبریدهای دو گونه از وزغ در طول گاسترولاسیون ممانعت می شود زیرا آن ها ترشح فیبریل فیبرونکتینی ندارند. به نظر میرسد که ماده ی زمینه ای از سقف بلاستوسل و قسمت هایی از ترکیبات فیبرونکتینی آن ها در مهاجرت سلول های مزودرمی در طول گاسترولاسیون دوزیستان مهم است.
تشکیل محور در دوزیستان: پدیده هایی از اندام زایی:
تشکیل محور دوزیستان مثالی از تکوین تنظیمی است زیرا: 1. بلاستومر جدا شده دارای توانایی بیشتری نسبت به سرنوشت طبیعی جنینی است. 2. سرنوشت سلول ها توسط واکنش های متقابل بین سلول های مجاور تعیین می شود که این واکنش ها القا نامیده می شود. نیاز به بر هم کنش های القایی در تعیین محور دوزیستان در آزمایشگاه اسپمان اثبات گردید. آزمایش های اسپمان و دانشجویانش سوالاتی را مطرح کرد که در سراسر قرن بیستم مورد توجه جنین شناسان تجربی بود و نتیجه ی آزمایشات جایزه ی نوبل را در سال 1935 برای اسپمان به ارمغان آورد. در حال حاضر کشف مولکول های مرتبط با مراحل القایی از مهیّج ترین مسائل در علوم معاصر است. تجربه ای که این برنامه ی تحقیقاتی را آغاز کرد در سال 1903 انجام شد یعنی زمانی که اسپمان ثابت کرد بلاستومر های اولیه ی سمندر دارای هسته ای مشخص یکسانی بوده و هر کدام ظرفیت تولید لارو کاملی را دارند. او کمی بعد از لقاح تخمک سمندر، با استفاده از موی دختر بچه اش تخم را در صفحه ی تسهیم اول گره زد و تا اندازه ای تخم را به هم فشرده و منقبض نمود. بدین وسیله باعث شد همه ی تقسیمات هسته ای در یک طرف این ناحیه ی منقبض شده باقی بماند. نهایتا در مرحله ی 16 سلولی بعضی از هسته ها از ناحیه ی منقبض شده به طرف بدون هسته فرار کرده و سپس تسهیم در این سمت آغاز شد. سپس اسپمان بند را محکم کرد تا اینکه این دو نیمه کاملا از هم جدا شوند. در این حالت لارو دو قلویی تکوین یافت، که یکی از دیگری پیشرفته تر بود.
اسپمان از این آزمایشات نتیجه گرفت که هسته های اولیه ی دوزیستان از نظر ژنتیکی یکسان اند و هر کدام از این سلول ها ظرفیت تبدیل شدن به موجود زنده ی کامل را دارند. به هر حال وقتی اسپمان آزمایش مشابهی را با انقباضی که به صورت طولی اما عمود بر سطح تسهیم اولیه بود انجام داد و نواحی پشتی و شکمی را به جای چپ و راست از هم جدا کرد، نتیجه ای کاملا متفاوتی را به دست آورد. هسته ها در دو طرف ناحیه ی منقبض شده به تقسیم ادامه دادند اما تنها یک طرف به لارو طبیعی تبدیل شد. طرف دیگر توده ی سازمان نیافته ی بافتی از سلول های شکمی تشکیل داد که اسپمان آن را قطعه ی شکمی نامید. این توده ی بافتی همانند توپی حاوی سلول های اپیدرمی، خون و مزانشیم ( مزودرم ) و سلول های لوله ی گوارش ( آندودرم ) بود. اما فاقد ساختار پشتی یعنی سیستم عصبی، نوتوکورد یا سومیت ها بود. چرا باید این دو آزمایش نتیجه ی متفاوتی می داد؟ یک امکان این است که وقتی تخم عمود بر سطح تسهیم اولیه تقسیم می شود، بعضی از مواد سیتوپلاسمی به طور مساوی توزیع نمی شود.خوشبختانه تخم سمندر نمونه ی خوب برای آزمایش این فرضیه بود. همان طور که مشاهده کردیم ، به دنبال لقاح تخمک دوزیستان ، حرکات قابل توجهی در سیتوپلاسم رخ می دهد و در بعضی از دوزیستان این حرکات باعث می شود ناحیه ی هلال خاکستری سیتوپلاسم مستقیما در مقابل نقطه ی ورود اسپرم نمایان شود. این ناحیه ؛ هلال خاکستری نامیده می شود. به علاوه در حالت طبیعی سطح تسهیم اولیه باعث می شود هلال خاکستری به طور مساوی بین دو بلاستومر تقسیم گردد. پس اگر این سلول ها را جدا کنیم ؛ دو لارو کامل تکوین می یابد. ولی اگر سطح تسهیم اولیه غیر عادی باشد (در اثر اتفاق طبیعی یا در آزمایش ) مواد هلال خاکستری تنها به یکی از دوبلاستومر منتقل می شود.اسپمان متوجه شد که وقتی دو بلاستومر جدا شوند، تنها بلاستومر حاوی هلال خاکستری به طور طبیعی تکوین می یابد. پس به نظر می رسد که وجود بعضی عوامل که در ناحیه ی هلال خاکستری قرار دارند، برای تکوین مناسب جنین ضروری باشد. اما هلال خاکستری چگونه عمل می کند؟ و چه نقشی در تکوین دارد؟
مهم ترین سرنخ برای رسیدن به پاسخ این سوالات از ترسیم نقشه ی سرنوشت این منطقه از تخم حاصل شد زیرا نشان داده شدکه ناحیه هلال خاکستری تبدیل به سلولهایی می شوند که گاسترولاسیون را را ه اندازی می کنند.این سلول ها ،سلول هایی هستند که لبه پشتی بلاستوپور را می سازند.سلول های لبه پشتی برای فرورفتن دربلاستولا متعهد شده اند بنابر این سبب گاسترولاسیون می شوند و نوتوکورد را تشکیل می دهند.زیرا همه ی آینده دوزیستان بستگی به واکنش های متقابل سلول های مرتب شده در طول گاسترولاسیون دارد. اسپمان اهمیت مواد هلال خاکستری رادرتوانایی آنها برای شروع گاسترولاسیون وایجاد تغییرات موثر در توانایی های سلولی در جریان گاسترولاسیون دانست.در سال 1918،اسپمان ثابت کردکه تغییرات بی شمار در توانایی ها سلولها درطول جریان گاسترولاسیون مورد نیاز است.اومتوجه شد که سلول های گاسترو لای اولیه غیر متعهد می باشند،اما سرنوشت سلول های گاسترولای انتهایی تعیین شده است.مشاهدات اسپمان با استفاده از مبادله ی بافت های گاسترولای دو گونه از سمندر که جنین آنها دارای رنگدانه متفاوتی بود انجام گرفت وقتی او سلو لهای ناحیه اپیدرمی آینده ی گاسترو لای اولیه را به منطقه ای در گاسترولا اولیه ی دیگری که به طور طبیعی بافت عصبی را تشکیل می دهند پیوند زد ،سلول های پیوند شده تبدیل به بافت عصبی شدند.همچنین زمانی که بافت عصبی آینده ی گاسترولای اولیه را به ناحیه ی که سرنوشت آن تبدیل به پوست ناحیه شکم است پیوند زد ،بافت عصبی به اپیدرم تبدیل شد.بنابراین سلولهای گاسترولا ی اولیه سمندر هنوز به سرنوشت خاصی متعهد نشده اند وچنین سلول هایی تکوین تنظیمی را نشان می دهند.زیرا سرنوشت نهایی شان بستگی به موقعیت شان در جنین دارد. از طرفی دیگر وقتی که اسپمان تجربیات پیوندی بین گونه ایی رابر روی گاسترولای انتهایی انجام داد،نتیجه کاملا متفاوتی را به دست آورد.در این حالت بیشتر از آنکه تمایز سلولی مطابق باموقعیت جدید سلول ها باشد،سلول های پیوند شده تکوین خود بخودی نشان می دهند.(تکوین مستقل یا
موزاییکی).در این حالت چنین عنوان می شود که سرنوشت آینده ی این سلول ها تعیین شده وآنها به طور مستقل از موقعیت جنینی شان تکوین می یابند.به عنوان مثال در این شرایط ،سلول های عصبی آینده حتی وقتی که در ناحیه ی اپیدرمی آینده قرار می گیرندبه بافت مغزی تکوین می یابند.واپیدرم آینده حتی در ناحیه لوله عصبی آینده پوست را تشکیل می دهند.بنابراین در فاصله زمانی ما بین گاسترولاسیون اولیه وانتهایی توانایی این گرد همایی سلولی محدود به مسیر های تمایزی نهایی شان شده است،چه عواملی باعث می شود که این سلول ها به سرنوشت اپیدرمی و عصبی متعهد شوند ؟
القای جنین اولیه
بیشترین نتایج آزمایشات پیوند ی توسط اسپمان ومنگولد در سال 1924منتشر شد.آنها نشان دادند که از تمام بافت های گاسترولا اولیه تنها سرنوشت یکی از بافتها تعیین شده است .این بافت خود تمایز یافته همان لبه پشتی بلا ستوپور است یعنی بافتی که از سیتوپلاسم هلال خاکستری مشتق می گردد.وقتی بافت لبه پشتی به پوست ناحیه شکمی فرضی گاسترولای دیگر پیوند زده شده نه تنها این ناحیه را به لبه بلاستوپور تبدیل کرده بلکه گاسترولاسیون وجنین زایی را در بافتهای پیرامونی به راه انداخته وباعث شد به جای یک جنین ،دو جنین به هم چسبیده ایجاد شود.در این آزمایشات ،اسپمان ومنگولد از جنین های متفاوت سمندر که جنس Triturus taeniatuse دارای رنگدانه و جنسTriturus Cristatus بدون رنگدانه بود استفاده کردند .تاوقتی که پیوند انجام شد بتوانند بافت های میزبان ودهنده را براساس رنگ آنها تشخیص دهند.وقتی لبه ی پشتی گاسترولای اولیه Triturus taeniatuse را برداشته ودر ناحیه ی ازگاسترولا ی اولیه Cristatus Triturus که سرنوشتش تبدیل به اپیدرم شکمی بود قرار گرفت، این بافت لبه ی پشتی درست همانطوری که به طور طبیعی عمل می کند، به درون رفته و در زیر سلول های نباتی ناپدید شد (تعیین خود به خودی ). بافت دهنده ی رنگدانه دار سپس به تمایز خود به خودی به مزودرم نوتوکورد و دیگر ساختارهای مزودرمی که به طور طبیعی از لبه ی پشتی تشکیل می شوند ادامه داد. همچنان که سلول های مزودرمی تازه مشتق شده از دهنده به پیش می رفتند، سلول های میزبان شروع به تولید جنین جدیدی کرده و اندام هایی را ایجاد کردند که به طور طبیعی هرگز چنین اندام هایی را تشکیل نمی دادند. آن ها در سومیت جنین ثانویه هر دو بافت رنگدانه دار (دهنده) و بدون رنگدانه (میزبان) را مشاهده کردند. جالب تر این که، سلول های پیوند شده قادر بودند تا با بافت های میزبان بر هم کنش نموده و در اکتودرم میزبان صفحه ی عصبی کاملی را به وجود آورند. نهایتا جنین ثانویه رو در روی میزبانش شکل گرفت. نتیجه ی این آزمایش ها چندین بار تکرار شد. اسپمان در سال 1938 به سلول های لبه ی پشتی و مشتقات آن ها (نوتوکورد و مزودرم سری) عنوان سازمان دهنده را اطلاق کرد. 1. زیرا این سلول ها با القای خود باعث تغییر سرنوشت بافت شکمی میزبان برای تشکیل لوله ی عصبی و بافت مزودرمی پشتی می شد. 2. همچنین موجب می شد که بافت های میزبان و دهنده برای تشکیل یک جنین ثانویه با محور قدامی- خلفی و پشتی- شکمی مشخص سازمان دهی شوند. او پیشنهاد کرد که این سلول ها در جریان تکوین طبیعی، اکتودرم پشتی را به لوله ی عصبی سازمان دهی کرد و مزودرم جانبی را به محور قدامی – خلفی بدن تغییر شکل می دهند. امروزه می دانیم که بر هم کنش مزودرم نوتوکوردی و اکتودرم برای سازمان دهی کافی نیست. بلکه این بر هم کنش یک سری از حوادث القایی متوالی را به راه می اندازد چنانچه یک ناحیه جنینی با یک ناحیه دوم واکنش می دهد که در تمایز ناحیه دوم یا رفتار تاثیر داشته باشد و القا نامیده می شود.
از آن جا که درجریان تکوین جنین القائات متعددی وجود دارد، این القای کلیدی که در آن تولید سلول های لبه ی پشتی، محور پشتی و لوله ی عصبی را القا می کنند و به طور سنتی القای جنین اولیه نامیده می شود.
مکانیزم های تعیین محور در دوزیستان:
تجربیات اسپمان و منگولد نشان داد که لبه ی پشتی بلاستوپور و مزودرم پشتی تشکیل می شوند، « سازمان دهنده» را تشکیل می دهند که می تواند محورهای جنینی جدید را هدایت کند. اما مکانیسمی که توسط این سازمان دهنده ساخته می شود و از طریق آن عمل می کند، به صورت یک راز باقی مانده است.این موضوع حقیقت دارد که گفته می شود مقاله ی اسپمان و منگولد ، سوالات بیشتری را در این ارتباط مطرح کرده تا این که سوالات قبلی را پاسخ دهد. در این جا این سوالات مطرح می شود؛ 1. چگونه این سازمان دهنده ها خصوصیاتشان را کسب می کنند؟ و چه چیزی باعث می شود که لبه ی پشتی بلاستوپور متفاوت از دیگر نواحی جنین شود. 2. چه عواملی از این سازمان دهند ها ترشح می شود که باعث تشکیل لوله ی عصبی و ایجاد محور های قدامی – خلفی،
پشتی – شکمی و چپ – راست می شود؟ 3. چگونه قسمت های مختلف لوله ی عصبی تثبیت می شوند و باعث می شود که قدامی ترین ناحیه ی آن اندام حسی و مغز قدامی و خلفی ترین قسمت آن طناب نخاعی را ایجاد کند؟
هر یک این سوالات را به ترتیب بررسی می کنیم.
منشا مرکز نیوکوپ:
یکی از نشانه های اصلی در تعیین این که چگونه لبه ی پشتی بلاستوپورخصوصیاتش را به دست می آورد حاصل تجربیات Pieter وهمکارانش در هلند بود نشان داد که خصوصیات مزودرم تازه تشکیل شده توسط سلول نباتی (آندودرم فرضی )زیر آن القا می شود . او سلول های استوایی (یعنی مزودرم فرضی )را از بلاستولا حذف کرد ونشان داد که نه کلاهک جانوری (اکتودرم فرضی )ونه کلاهک نباتی (آندودرم فرضی)هیچ بافت مزودرمی راایجاد نمی کند.اما وقتی که این دو کلاهک بایکدیگر ترکیب می شوند،سلولها ی کلاهک حیوانی برای تشکیل سلول های مزودرمی نظیر نوتوکورد،عضلات، سلول های کلیوی وسلول های خونی القا می شوند. قطبیت این القا (که سلولهای حیوانی مزودرم پشتی وشکمی را تشکیل می دهند)بستگی به این دارد که قطعه آندودرم ( نباتی ) از طرف پشتی یا شکمی گرفته می شود.هنگامی که سلول های نباتی جانبی وشکمی (آنهایی که به محل ورود اسپرم نزیکترند)مزودرم شکمی (مزانشیم وخون) و مزودرم بینابینی (عضله وکلیه ) را القا می کند، در صورتی که پشتی ترین سلول های نباتی اجزای مزودرم پشتی (سومیت ونوتوکورد)را تخصصی می کنند. (همان اجزایی که دارای خصوصیات سازمان دهنده هستند) پشتی ترین سلول های نباتی بلاستولا که ظرفیت القای این سازمان دهنده را دارند ،مرکز نیو کوپ نامیده می شود. مرکز نیو کوپ در جنین 32 سلولی زنوپوس با آزمایشات پیوندی و نوترکیبی نشان داده شد.ابتدا Ger hart Gimlich,آزمایشاتی مشابه اسپمان ومنگولدانجام دادند، با این تفاوت که آنها به جای گاسترولا از بلاستولای اولیه استفاده کردند.وقتی آنها پشتی ترین بلاستومرنباتی یک بلاستولا را به طرف نباتی شکمی بلاستولا ی دیگر پیوند زدند ،دو محور جنینی تشکیل شد. دوما ،Dalوslak (1987) بلاستومرهای نباتی مغز جنین زنوپوس 32 سلولی را با بالاترین ردیف سلول های حیوانی از همان مرحله که توسط مواد فلورسنت نشان دار شده بودند ترکیب کردند. همانطور که انتظار میرفت،پشتی ترین سلول های نباتی ،سلول های قطب حیوانی را برای تبدیل به مزودرم پشتی القا می کرد.بقیه سلول های نباتی معمولا سلول های حیوانی را برای تولید بافت های مزودرم بینابینی و شکمی القا می کرد.بنابر این سلولهای نباتی پشتی می توانند سلول های حیوانی را برای تبدیل به بافت مزودرم پشتی القا کنند.مرکز نیوکوپ به وسیله چرخش سیتوپلاسمی در طول لقاح ایجاد می شود. وقتی این چرخش توسط اشعه uv ممانعت می شود،جنین حاصل ساختار پشتی –جلویی مانند سر یا لوله عصبی را تشکیل نخواهد داد. به هر حال ، جنین های تیمار شده با اشعه uvتوسط پیوند بلاستومرهای نباتی پشتی از یک جنین نرمال در مرحله 32سلولی می توانند جدا شوند.
(تخم پرتو دیده بدون انجام این پیوند قادر به طی گاسترولاسیون نمی شود.) در تخم هایی که از ابتدای چرخه سلولی به انتها نزدیک می شوند، سمت شکمی آینده به سمت بالا است ودو مرکز نیوکوپ تشکیل شده ، دو لبه ی بلاستوپور پشتی و دو محور جنینی را هدایت می کند. به هر حال تخصصی شدن محور پشتی شکمی در لحظه ورود اسپرم آغاز می شود.
مولکول های زیستی مرکز نیوکوپ:
در زنوپوس ،آندودرم می تواند شکلی از سلول های مزودرم فرضی را توسط بیان ژن براچوری زنوپوس (xbra)القا کند.مکانیسم این القا به خوبی شناخته نشده است. مشاهدات Gerhhart&Har land در سال 1997 نشان داد که پروتئین Xbraیک فاکتور رونویسی است که ژنهای تولید کننده خاص مزودرم را فعال می کند. در حالی که همه سلول های نباتی پشتی می توانند جهت تبدیل به مزودرم به سلول های حاشیه بالایی القا می شوند تنها سلول های نباتی پشتی، سلول های حاشیه پشتی رویی را به سمت سازمان دهی هدایت می کنند. کاندید اصلی برای عاملی که مرکز نیوکوپ را در پشتی ترین سلولهای نباتی شکل می دهد ، B-catenin نامیده می شود.بتا کتنین پروتئینی با چندین عملکرد است که می تواند به عنوان لنگری برای کادهرین های غشای سلولی یا به عنوان عامل رونویسی هسته ای عمل کند.در جنین زنوپوس بتاکتنین در جریان حرکات سیتوپلاسمی لقاح شروع به تجمع در ناحیه ی پشتی تخم کرده ودر مراحل ابتدایی تسهیم نیز ترجیحا به تجمع خود در سمت پشتی ادامه می دهد واین تجمع در هسته های سلول های پشتی مشاهده می گردد. و این ناحیه از بتا کتنین تجمع یافته به نظر می رسد که هردو ناحیه مرکز نیوکوپ وسازمان دهنده راشامل می شود.در طول تسهیم بعدی ،سلول های حاوی بتا کتنین شاید به طور تخصصی در مرکز نیوکوپ باقی بماند.
بتا کتنین برای تشکیل محور پشتی ضروری است.زیرا حذف آزمایشی رونویسی بتا کتنین با آنتی سنس الیگونوکلئوتیدها منجر به فقدان ساختار پشتی می گردد. علاوه بر این، تزریق بتاکتنین اگزوژنوس در سمت شکمی جنین منجر به ایجاد محور ثانویه می شود. بتا کتنین بخشی از مسیر انتقال سیگنالی Wnt است و توسط گلیکوژن سنتتاز کیناز3 ) ( Gsk3 به صورت منفی تنظیم می شود. همچنین Gsk3 یک نقش بحرانی در تشکیل محور با توقف قسمت های پشتی دارد. وقتی Gsk3فعال به تخم اضافه می شود، از تشکیل محور جلوگیری می کند. اگر Gsk3آندوژنوس توسط پروتئین منفی غالب در سلول شکمی جنین اولیه از کار انداخته شود ،یک محور ثانویه تشکیل می شود.
بنابر این بتا کتنین چگونه می تواند روی سلول های پشتی آینده بلاستولا تجمع یابد؟
آزمایشات مستند توضیح می دهد که بتا کتنین آغاز کننده سنتز در سراسر جنین است. اما توسط Gsk3 واسط فسفوریلاسیون تخصص یافته سلول های شکمی کاهش می یابد. شاید پدیده مهم برای تعیین محور حرکت ممانعت کننده Gsk3 به سیتوپلاسم مقابل نقطه ای که اسپرم وارد می شود باشد. (یعنی به طرف سلول پشتی آینده).یک کاندید برای این عامل پروتئین Disheveled است.این پروتئین ممانعت کننده طبیعی از Gsk3 در مسیرWnt است .شکل (23-6)واین پروتئین ابتدا در قشر نباتی تخم زنوپوس لقاح نیافته کشف شده است .به هر حال در لقاح به پروتئین Disheveled انتقال یافته همراه میکروتوبول های نظم یافته در سمت پشتی جنین وابسته است. بنابراین روی طرف پشتی بتا کتنین باید ثابت باشد زیرا Gsk3 نمی تواند آن را کاهش دهد.ولی درسمت شکمی جنین Gsk3 باید کاهش بتا کتنین را آغاز کند.(بتا کتنین تجزیه می شود.)بتا کتنین به عنوان عامل رونویسی می تواند به عوامل رونویسی دیگر پیوسته وخصوصیات جدیدی به آنها بدهد. بتا کتنین زنوپوس می تواند با عامل رونویسی فراگیری که به عنوان Tcf3 شناخته می شود ترکیب شود. شکل جهش یافته که فاقد ناحیه ی متصل شونده به بتا کتنین است باعث می شود جنین هایی فاقد ساختار پشتی به وجود آیند .کمپلکسB-catenin / Tcf3 به پروموتور چندین ژن که نقش مهمی در تشکیل محور دارندمتصل می شودsiamois. یکی از ژنها یی است که در مرکز نیوکوپ بلافاصله به دنبال مرحله گذار بلاستولای میانی بیان می شوند.اگر این ژن به طور نابجا در سلول های نباتی شکمی بیان می شوند یک محور ثانویه روی طرف شکمی قبلی جنین پدیدار می شود. و اگر از چرخش قشری جلوگیری شود siamois حذف می شود.به نظر می رسد که پروتئین Tcf3در غیاب بتا کتنین به راه انداز siamois متصل شده ورونویسی آن را متوقف می کند.به هر حال وقتی که
کمپلکسB-catenin / Tcf3 به پروموتور متصل می شود ، siamoisفعال می شود. پروتئین های siamois برای بیان ژنهای ویژه سازمان دهنده ضروری می باشند. پروتئین های siamois به پروموتور ژن goosecoid متصل می شودو بیان آن رافعال می کند به نظر می رسد پروتئینgoosecoid برای فعالیت چندین ژن در سازمان دهنده های اسپمان(تخصصی شدن مزودرم پشتی ) ضروری است.بنابراین می توان انتظار داشت که طرف پشتی جنین حاوی بتا کتنین است ،که بتا کتنین اجازه بیان ژن siamois را داده وبیان این ژن تشکیل سازمان دهند ها را به راه می اندازد.اما siamois به تنهایی برای تولید سازمان دهنده ها کافی نبوده وبه نظر می رسد پروتئین دیگری نیز در فعال کردن ژنgoosecoid وتشکیل سازمان دهنده ضروری است .مطالعات اخیر پیشنهاد می کند که حداکثر بیان goosecoid زمانی رخ می دهد که بین پروتئینsiamois و بیان سیگنال TGF-βاز سلول های نباتی همزمان باشد. هنگام چرخش قشر شاید بتا کتنین فعال شود و اجازه می دهد siamois در ناحیه ی پشتی جنین بیان شود .انتقال پیام مشخص رمز گذاری یک فاکتور از خانواده TGF-β شاید تولید پروتئین راآغاز می کندکه بیشترین فعالیت goosecoid در سلول هایی که تبدیل به سازمان دهنده می شود را تحریک کند. خانواده پروتئین TGF-β در مرکز نیوکوپ می تواند سلول های ناحیه پشتی بالایی را برای بیان عوامل رونویسی که به پروموتور ژن goosecoid متصل می شود را القا کند و برای فعال کردن این ژن با پروتئین siamois همکاری می کند. کاندیدی برای القا فاکتور TGF-βپروتئین وابسته به vg1,vegT,Nodal است که هریک از این پروتئین ها در آندودرم ساخته می شوند. آگوست وهمکارانش نشان دادند که همه ی این پروتئین ها شاید در این مسیر عمل کننداما پروتئین های بحرانی در تخصصی شدن مزودرم فاکتور های وابسته به Nodal هستند.وقتی آنها تجربیات نوترکیبی حیوانی –نباتی نیوکوپ را درحالی که مهارکننده ویژه ای از پروتئین وابسته به Nodal را به کار می بردند تکرارکردند مشاهده کردندکه عمل القا کننده سلول های نباتی ازبین می رود. (البته این مهار کننده vg1,vegTواکتیوین راغیر فعال کرد).در حالی که درجریان مرحله نهایی بلاستولا سه پروتئین وابسته بهNodal شاملXnr1,Xnr2,Xnr3 که بایک شیب پشتی – شکمی در آندودرم بیان می شوند.این شیب توسط بیان ژن وابسته به نودال زنوپوس که دراثر همکاری vg1,vegTبابتاکتنین فعال می شود ، ایجاد می گردد. آگوست وهمکارانش مدلی ارائه کردند. در این مدل پیام های بتا کتنین که درناحیه پشتی قرار گرفته وپیام vg1 که در ناحیه نباتی قرار گرفته اندبرای ایجاد شیبی از پروتئین وابسته بهNodal شاملXnr1,Xnr2,Xnr3)) در سر تاسر آندودرم با یکدیگر بر همکنش دارند.این پروتئین وابسته به Nodal در تخصص یافتگی مزودرمی نقش دارند. مناطقی که داری مقداربسیارکمی از این پروتئین ها هستندیا اصلا ندارند به مزودرم شکمی تبدیل شدند، مناطقی که دارای مقدار بیشتری بودند به مزودرم جانبی تبدیل شدند،و سرانجام مناطقی که دارای مقادیر خیلی بالا بودند به سازمان دهنده تبدیل می گردند. این پروتئین های وابسته به نودال، ژن goosecoid را فعال خواهد کرد و ممانعت کننده های تخصصی پروتئین وابسته به نودال مانع این فعالیت می شوند.
اعمال سازمان دهنده ها :
در حالی که سلول های مرکز نیوکوپ آندودرمی باقی می مانند،سلول های سازمان دهنده تبدیل به مزودرم پشتی شده و زیر اکتودرم مهاجرت می کنند. این مزودم پشتی تشکیل سیستم عصبی مرکزی را القا می کند. خصو صیات بافت سازمان دهنده را می توان به پنج عمل اصلی تقسیم کرد:
1- توانایی تمایز خود بخودی مزودرم پشتی(صفحه پری کوردال – مزودم نوتوکورد و غیره)
2- توانایی پشتی کنندگی مزودرم اطراف و ایجاد مزودرم مجاور مزودم جانبی (در صورتی که طرف دیگر مزودرم شکمی تشکیل می دهند)
3- توانایی پشتی کنندگی اکتودرم درمجاور اکتودرم عصبی.
4- توانایی به کاراندازی حرکات گاسترولاسیون
5- توانایی ایجاد صفحه عصبی (القا اکتودرم عصبی ) به لوله عصبی.
در زنوپوس و دیگر مهره داران تشکیل محور قدامی – خلفی به دنبال تشکیل محور پشتی – شکمی است.به محض این که بخش پشتی جنین تثبیت می شود ، حرکت درون خزیدگی مزدرم، محور قدامی - خلفی راتثبیت می کند. مزودرمی که درابتدا از بالای لبه پشتی بلاستو پور مهاجرت می کند ساختار های قدامی را ایجاد می کند و مزودرمی که از بالای لبه شکمی وجانبی مهاجرت می کند ساختار های خلفی را ایجاد می کند. در حال حاضر عقیده بر این است که سلول های سازمان دهنده نهایتا درتشکیل 4 نوع سلول یعنی آندودرم حلقی، مزودرم سری(صفحه پری کوردال)،مزدرم پشتی عمدتا نوتوکورد و لبه پشتی بلاستوپور شرکت می کنند. آندودرم حلقی وصفحه پری کوردال روند مهاجرت بافت سازمان دهنده را هدایت کرده و مغز قدامی و میانی رالقا می کند. مزودرم پشتی نیز مغز خلفی وتنه را القا می کند .لبه پشتی بلاستوپور مزودرم پشتی راتشکیل می دهد و نهایتا به محور کوردانورال تبدیل می شود ،که راس دم را القا می کند.
بنابر این ،فعال شدن چندین ژن باعث تشکیل مزودرم پشتی می شود. تصور می شود که پروتئین های مترشحه از مرکز نیوکوپ مجموعه ای از عوامل رونویسی رادر سلول های مزودرمی فعال می کند. این عوامل رونویسی نیز ژن های کد کننده مولکول های مترشحه از سازمان دهنده را فعال می سازد. تا کنون چندین عامل رونویسی ویژه ی سازمان دهنده شناسایی گردیده که در جدول زیر لیست شده است.
تشکیل محور در دوزیستان: پدیده هایی از اندام زایی:
تشکیل محور دوزیستان مثالی از تکوین تنظیمی است زیرا: 1. بلاستومر جدا شده دارای توانایی بیشتری نسبت به سرنوشت طبیعی جنینی است. 2. سرنوشت سلول ها توسط واکنش های متقابل بین سلول های مجاور تعیین می شود که این واکنش ها القا نامیده می شود. نیاز به بر هم کنش های القایی در تعیین محور دوزیستان در آزمایشگاه اسپمان اثبات گردید. آزمایش های اسپمان و دانشجویانش سوالاتی را مطرح کرد که در سراسر قرن بیستم مورد توجه جنین شناسان تجربی بود و نتیجه ی آزمایشات جایزه ی نوبل را در سال 1935 برای اسپمان به ارمغان آورد. در حال حاضر کشف مولکول های مرتبط با مراحل القایی از مهیّج ترین مسائل در علوم معاصر است. تجربه ای که این برنامه ی تحقیقاتی را آغاز کرد در سال 1903 انجام شد یعنی زمانی که اسپمان ثابت کرد بلاستومر های اولیه ی سمندر دارای هسته ای مشخص یکسانی بوده و هر کدام ظرفیت تولید لارو کاملی را دارند. او کمی بعد از لقاح تخمک سمندر، با استفاده از موی دختر بچه اش تخم را در صفحه ی تسهیم اول گره زد و تا اندازه ای تخم را به هم فشرده و منقبض نمود. بدین وسیله باعث شد همه ی تقسیمات هسته ای در یک طرف این ناحیه ی منقبض شده باقی بماند. نهایتا در مرحله ی 16 سلولی بعضی از هسته ها از ناحیه ی منقبض شده به طرف بدون هسته فرار کرده و سپس تسهیم در این سمت آغاز شد. سپس اسپمان بند را محکم کرد تا اینکه این دو نیمه کاملا از هم جدا شوند. در این حالت لارو دو قلویی تکوین یافت، که یکی از دیگری پیشرفته تر بود.
اسپمان از این آزمایشات نتیجه گرفت که هسته های اولیه ی دوزیستان از نظر ژنتیکی یکسان اند و هر کدام از این سلول ها ظرفیت تبدیل شدن به موجود زنده ی کامل را دارند. به هر حال وقتی اسپمان آزمایش مشابهی را با انقباضی که به صورت طولی اما عمود بر سطح تسهیم اولیه بود انجام داد و نواحی پشتی و شکمی را به جای چپ و راست از هم جدا کرد، نتیجه ای کاملا متفاوتی را به دست آورد. هسته ها در دو طرف ناحیه ی منقبض شده به تقسیم ادامه دادند اما تنها یک طرف به لارو طبیعی تبدیل شد. طرف دیگر توده ی سازمان نیافته ی بافتی از سلول های شکمی تشکیل داد که اسپمان آن را قطعه ی شکمی نامید. این توده ی بافتی همانند توپی حاوی سلول های اپیدرمی، خون و مزانشیم ( مزودرم ) و سلول های لوله ی گوارش ( آندودرم ) بود. اما فاقد ساختار پشتی یعنی سیستم عصبی، نوتوکورد یا سومیت ها بود. چرا باید این دو آزمایش نتیجه ی متفاوتی می داد؟ یک امکان این است که وقتی تخم عمود بر سطح تسهیم اولیه تقسیم می شود، بعضی از مواد سیتوپلاسمی به طور مساوی توزیع نمی شود.خوشبختانه تخم سمندر نمونه ی خوب برای آزمایش این فرضیه بود. همان طور که مشاهده کردیم ، به دنبال لقاح تخمک دوزیستان ، حرکات قابل توجهی در سیتوپلاسم رخ می دهد و در بعضی از دوزیستان این حرکات باعث می شود ناحیه ی هلال خاکستری سیتوپلاسم مستقیما در مقابل نقطه ی ورود اسپرم نمایان شود. این ناحیه ؛ هلال خاکستری نامیده می شود. به علاوه در حالت طبیعی سطح تسهیم اولیه باعث می شود هلال خاکستری به طور مساوی بین دو بلاستومر تقسیم گردد. پس اگر این سلول ها را جدا کنیم ؛ دو لارو کامل تکوین می یابد. ولی اگر سطح تسهیم اولیه غیر عادی باشد (در اثر اتفاق طبیعی یا در آزمایش ) مواد هلال خاکستری تنها به یکی از دوبلاستومر منتقل می شود.اسپمان متوجه شد که وقتی دو بلاستومر جدا شوند، تنها بلاستومر حاوی هلال خاکستری به طور طبیعی تکوین می یابد. پس به نظر می رسد که وجود بعضی عوامل که در ناحیه ی هلال خاکستری قرار دارند، برای تکوین مناسب جنین ضروری باشد. اما هلال خاکستری چگونه عمل می کند؟ و چه نقشی در تکوین دارد؟
مهم ترین سرنخ برای رسیدن به پاسخ این سوالات از ترسیم نقشه ی سرنوشت این منطقه از تخم حاصل شد زیرا نشان داده شدکه ناحیه هلال خاکستری تبدیل به سلولهایی می شوند که گاسترولاسیون را را ه اندازی می کنند.این سلول ها ،سلول هایی هستند که لبه پشتی بلاستوپور را می سازند.سلول های لبه پشتی برای فرورفتن دربلاستولا متعهد شده اند بنابر این سبب گاسترولاسیون می شوند و نوتوکورد را تشکیل می دهند.زیرا همه ی آینده دوزیستان بستگی به واکنش های متقابل سلول های مرتب شده در طول گاسترولاسیون دارد. اسپمان اهمیت مواد هلال خاکستری رادرتوانایی آنها برای شروع گاسترولاسیون وایجاد تغییرات موثر در توانایی های سلولی در جریان گاسترولاسیون دانست.در سال 1918،اسپمان ثابت کردکه تغییرات بی شمار در توانایی ها سلولها درطول جریان گاسترولاسیون مورد نیاز است.اومتوجه شد که سلول های گاسترو لای اولیه غیر متعهد می باشند،اما سرنوشت سلول های گاسترولای انتهایی تعیین شده است.مشاهدات اسپمان با استفاده از مبادله ی بافت های گاسترولای دو گونه از سمندر که جنین آنها دارای رنگدانه متفاوتی بود انجام گرفت وقتی او سلو لهای ناحیه اپیدرمی آینده ی گاسترو لای اولیه را به منطقه ای در گاسترولا اولیه ی دیگری که به طور طبیعی بافت عصبی را تشکیل می دهند پیوند زد ،سلول های پیوند شده تبدیل به بافت عصبی شدند.همچنین زمانی که بافت عصبی آینده ی گاسترولای اولیه را به ناحیه ی که سرنوشت آن تبدیل به پوست ناحیه شکم است پیوند زد ،بافت عصبی به اپیدرم تبدیل شد.بنابراین سلولهای گاسترولا ی اولیه سمندر هنوز به سرنوشت خاصی متعهد نشده اند وچنین سلول هایی تکوین تنظیمی را نشان می دهند.زیرا سرنوشت نهایی شان بستگی به موقعیت شان در جنین دارد. از طرفی دیگر وقتی که اسپمان تجربیات پیوندی بین گونه ایی رابر روی گاسترولای انتهایی انجام داد،نتیجه کاملا متفاوتی را به دست آورد.در این حالت بیشتر از آنکه تمایز سلولی مطابق باموقعیت جدید سلول ها باشد،سلول های پیوند شده تکوین خود بخودی نشان می دهند.(تکوین مستقل یا
موزاییکی).در این حالت چنین عنوان می شود که سرنوشت آینده ی این سلول ها تعیین شده وآنها به طور مستقل از موقعیت جنینی شان تکوین می یابند.به عنوان مثال در این شرایط ،سلول های عصبی آینده حتی وقتی که در ناحیه ی اپیدرمی آینده قرار می گیرندبه بافت مغزی تکوین می یابند.واپیدرم آینده حتی در ناحیه لوله عصبی آینده پوست را تشکیل می دهند.بنابراین در فاصله زمانی ما بین گاسترولاسیون اولیه وانتهایی توانایی این گرد همایی سلولی محدود به مسیر های تمایزی نهایی شان شده است،چه عواملی باعث می شود که این سلول ها به سرنوشت اپیدرمی و عصبی متعهد شوند ؟
القای جنین اولیه
بیشترین نتایج آزمایشات پیوند ی توسط اسپمان ومنگولد در سال 1924منتشر شد.آنها نشان دادند که از تمام بافت های گاسترولا اولیه تنها سرنوشت یکی از بافتها تعیین شده است .این بافت خود تمایز یافته همان لبه پشتی بلا ستوپور است یعنی بافتی که از سیتوپلاسم هلال خاکستری مشتق می گردد.وقتی بافت لبه پشتی به پوست ناحیه شکمی فرضی گاسترولای دیگر پیوند زده شده نه تنها این ناحیه را به لبه بلاستوپور تبدیل کرده بلکه گاسترولاسیون وجنین زایی را در بافتهای پیرامونی به راه انداخته وباعث شد به جای یک جنین ،دو جنین به هم چسبیده ایجاد شود.در این آزمایشات ،اسپمان ومنگولد از جنین های متفاوت سمندر که جنس Triturus taeniatuse دارای رنگدانه و جنسTriturus Cristatus بدون رنگدانه بود استفاده کردند .تاوقتی که پیوند انجام شد بتوانند بافت های میزبان ودهنده را براساس رنگ آنها تشخیص دهند.وقتی لبه ی پشتی گاسترولای اولیه Triturus taeniatuse را برداشته ودر ناحیه ی ازگاسترولا ی اولیه Cristatus Triturus که سرنوشتش تبدیل به اپیدرم شکمی بود قرار گرفت، این بافت لبه ی پشتی درست همانطوری که به طور طبیعی عمل می کند، به درون رفته و در زیر سلول های نباتی ناپدید شد (تعیین خود به خودی ). بافت دهنده ی رنگدانه دار سپس به تمایز خود به خودی به مزودرم نوتوکورد و دیگر ساختارهای مزودرمی که به طور طبیعی از لبه ی پشتی تشکیل می شوند ادامه داد. همچنان که سلول های مزودرمی تازه مشتق شده از دهنده به پیش می رفتند، سلول های میزبان شروع به تولید جنین جدیدی کرده و اندام هایی را ایجاد کردند که به طور طبیعی هرگز چنین اندام هایی را تشکیل نمی دادند. آن ها در سومیت جنین ثانویه هر دو بافت رنگدانه دار (دهنده) و بدون رنگدانه (میزبان) را مشاهده کردند. جالب تر این که، سلول های پیوند شده قادر بودند تا با بافت های میزبان بر هم کنش نموده و در اکتودرم میزبان صفحه ی عصبی کاملی را به وجود آورند. نهایتا جنین ثانویه رو در روی میزبانش شکل گرفت. نتیجه ی این آزمایش ها چندین بار تکرار شد. اسپمان در سال 1938 به سلول های لبه ی پشتی و مشتقات آن ها (نوتوکورد و مزودرم سری) عنوان سازمان دهنده را اطلاق کرد. 1. زیرا این سلول ها با القای خود باعث تغییر سرنوشت بافت شکمی میزبان برای تشکیل لوله ی عصبی و بافت مزودرمی پشتی می شد. 2. همچنین موجب می شد که بافت های میزبان و دهنده برای تشکیل یک جنین ثانویه با محور قدامی- خلفی و پشتی- شکمی مشخص سازمان دهی شوند. او پیشنهاد کرد که این سلول ها در جریان تکوین طبیعی، اکتودرم پشتی را به لوله ی عصبی سازمان دهی کرد و مزودرم جانبی را به محور قدامی – خلفی بدن تغییر شکل می دهند. امروزه می دانیم که بر هم کنش مزودرم نوتوکوردی و اکتودرم برای سازمان دهی کافی نیست. بلکه این بر هم کنش یک سری از حوادث القایی متوالی را به راه می اندازد چنانچه یک ناحیه جنینی با یک ناحیه دوم واکنش می دهد که در تمایز ناحیه دوم یا رفتار تاثیر داشته باشد و القا نامیده می شود.
از آن جا که درجریان تکوین جنین القائات متعددی وجود دارد، این القای کلیدی که در آن تولید سلول های لبه ی پشتی، محور پشتی و لوله ی عصبی را القا می کنند و به طور سنتی القای جنین اولیه نامیده می شود.
مکانیزم های تعیین محور در دوزیستان:
تجربیات اسپمان و منگولد نشان داد که لبه ی پشتی بلاستوپور و مزودرم پشتی تشکیل می شوند، « سازمان دهنده» را تشکیل می دهند که می تواند محورهای جنینی جدید را هدایت کند. اما مکانیسمی که توسط این سازمان دهنده ساخته می شود و از طریق آن عمل می کند، به صورت یک راز باقی مانده است.این موضوع حقیقت دارد که گفته می شود مقاله ی اسپمان و منگولد ، سوالات بیشتری را در این ارتباط مطرح کرده تا این که سوالات قبلی را پاسخ دهد. در این جا این سوالات مطرح می شود؛ 1. چگونه این سازمان دهنده ها خصوصیاتشان را کسب می کنند؟ و چه چیزی باعث می شود که لبه ی پشتی بلاستوپور متفاوت از دیگر نواحی جنین شود. 2. چه عواملی از این سازمان دهند ها ترشح می شود که باعث تشکیل لوله ی عصبی و ایجاد محور های قدامی – خلفی،
پشتی – شکمی و چپ – راست می شود؟ 3. چگونه قسمت های مختلف لوله ی عصبی تثبیت می شوند و باعث می شود که قدامی ترین ناحیه ی آن اندام حسی و مغز قدامی و خلفی ترین قسمت آن طناب نخاعی را ایجاد کند؟
هر یک این سوالات را به ترتیب بررسی می کنیم.
منشا مرکز نیوکوپ:
یکی از نشانه های اصلی در تعیین این که چگونه لبه ی پشتی بلاستوپورخصوصیاتش را به دست می آورد حاصل تجربیات Pieter وهمکارانش در هلند بود نشان داد که خصوصیات مزودرم تازه تشکیل شده توسط سلول نباتی (آندودرم فرضی )زیر آن القا می شود . او سلول های استوایی (یعنی مزودرم فرضی )را از بلاستولا حذف کرد ونشان داد که نه کلاهک جانوری (اکتودرم فرضی )ونه کلاهک نباتی (آندودرم فرضی)هیچ بافت مزودرمی راایجاد نمی کند.اما وقتی که این دو کلاهک بایکدیگر ترکیب می شوند،سلولها ی کلاهک حیوانی برای تشکیل سلول های مزودرمی نظیر نوتوکورد،عضلات، سلول های کلیوی وسلول های خونی القا می شوند. قطبیت این القا (که سلولهای حیوانی مزودرم پشتی وشکمی را تشکیل می دهند)بستگی به این دارد که قطعه آندودرم ( نباتی ) از طرف پشتی یا شکمی گرفته می شود.هنگامی که سلول های نباتی جانبی وشکمی (آنهایی که به محل ورود اسپرم نزیکترند)مزودرم شکمی (مزانشیم وخون) و مزودرم بینابینی (عضله وکلیه ) را القا می کند، در صورتی که پشتی ترین سلول های نباتی اجزای مزودرم پشتی (سومیت ونوتوکورد)را تخصصی می کنند. (همان اجزایی که دارای خصوصیات سازمان دهنده هستند) پشتی ترین سلول های نباتی بلاستولا که ظرفیت القای این سازمان دهنده را دارند ،مرکز نیو کوپ نامیده می شود. مرکز نیو کوپ در جنین 32 سلولی زنوپوس با آزمایشات پیوندی و نوترکیبی نشان داده شد.ابتدا Ger hart Gimlich,آزمایشاتی مشابه اسپمان ومنگولدانجام دادند، با این تفاوت که آنها به جای گاسترولا از بلاستولای اولیه استفاده کردند.وقتی آنها پشتی ترین بلاستومرنباتی یک بلاستولا را به طرف نباتی شکمی بلاستولا ی دیگر پیوند زدند ،دو محور جنینی تشکیل شد. دوما ،Dalوslak (1987) بلاستومرهای نباتی مغز جنین زنوپوس 32 سلولی را با بالاترین ردیف سلول های حیوانی از همان مرحله که توسط مواد فلورسنت نشان دار شده بودند ترکیب کردند. همانطور که انتظار میرفت،پشتی ترین سلول های نباتی ،سلول های قطب حیوانی را برای تبدیل به مزودرم پشتی القا می کرد.بقیه سلول های نباتی معمولا سلول های حیوانی را برای تولید بافت های مزودرم بینابینی و شکمی القا می کرد.بنابر این سلولهای نباتی پشتی می توانند سلول های حیوانی را برای تبدیل به بافت مزودرم پشتی القا کنند.مرکز نیوکوپ به وسیله چرخش سیتوپلاسمی در طول لقاح ایجاد می شود. وقتی این چرخش توسط اشعه uv ممانعت می شود،جنین حاصل ساختار پشتی –جلویی مانند سر یا لوله عصبی را تشکیل نخواهد داد. به هر حال ، جنین های تیمار شده با اشعه uvتوسط پیوند بلاستومرهای نباتی پشتی از یک جنین نرمال در مرحله 32سلولی می توانند جدا شوند.
(تخم پرتو دیده بدون انجام این پیوند قادر به طی گاسترولاسیون نمی شود.) در تخم هایی که از ابتدای چرخه سلولی به انتها نزدیک می شوند، سمت شکمی آینده به سمت بالا است ودو مرکز نیوکوپ تشکیل شده ، دو لبه ی بلاستوپور پشتی و دو محور جنینی را هدایت می کند. به هر حال تخصصی شدن محور پشتی شکمی در لحظه ورود اسپرم آغاز می شود.
مولکول های زیستی مرکز نیوکوپ:
در زنوپوس ،آندودرم می تواند شکلی از سلول های مزودرم فرضی را توسط بیان ژن براچوری زنوپوس (xbra)القا کند.مکانیسم این القا به خوبی شناخته نشده است. مشاهدات Gerhhart&Har land در سال 1997 نشان داد که پروتئین Xbraیک فاکتور رونویسی است که ژنهای تولید کننده خاص مزودرم را فعال می کند. در حالی که همه سلول های نباتی پشتی می توانند جهت تبدیل به مزودرم به سلول های حاشیه بالایی القا می شوند تنها سلول های نباتی پشتی، سلول های حاشیه پشتی رویی را به سمت سازمان دهی هدایت می کنند. کاندید اصلی برای عاملی که مرکز نیوکوپ را در پشتی ترین سلولهای نباتی شکل می دهد ، B-catenin نامیده می شود.بتا کتنین پروتئینی با چندین عملکرد است که می تواند به عنوان لنگری برای کادهرین های غشای سلولی یا به عنوان عامل رونویسی هسته ای عمل کند.در جنین زنوپوس بتاکتنین در جریان حرکات سیتوپلاسمی لقاح شروع به تجمع در ناحیه ی پشتی تخم کرده ودر مراحل ابتدایی تسهیم نیز ترجیحا به تجمع خود در سمت پشتی ادامه می دهد واین تجمع در هسته های سلول های پشتی مشاهده می گردد. و این ناحیه از بتا کتنین تجمع یافته به نظر می رسد که هردو ناحیه مرکز نیوکوپ وسازمان دهنده راشامل می شود.در طول تسهیم بعدی ،سلول های حاوی بتا کتنین شاید به طور تخصصی در مرکز نیوکوپ باقی بماند.
بتا کتنین برای تشکیل محور پشتی ضروری است.زیرا حذف آزمایشی رونویسی بتا کتنین با آنتی سنس الیگونوکلئوتیدها منجر به فقدان ساختار پشتی می گردد. علاوه بر این، تزریق بتاکتنین اگزوژنوس در سمت شکمی جنین منجر به ایجاد محور ثانویه می شود. بتا کتنین بخشی از مسیر انتقال سیگنالی Wnt است و توسط گلیکوژن سنتتاز کیناز3 ) ( Gsk3 به صورت منفی تنظیم می شود. همچنین Gsk3 یک نقش بحرانی در تشکیل محور با توقف قسمت های پشتی دارد. وقتی Gsk3فعال به تخم اضافه می شود، از تشکیل محور جلوگیری می کند. اگر Gsk3آندوژنوس توسط پروتئین منفی غالب در سلول شکمی جنین اولیه از کار انداخته شود ،یک محور ثانویه تشکیل می شود.
بنابر این بتا کتنین چگونه می تواند روی سلول های پشتی آینده بلاستولا تجمع یابد؟
آزمایشات مستند توضیح می دهد که بتا کتنین آغاز کننده سنتز در سراسر جنین است. اما توسط Gsk3 واسط فسفوریلاسیون تخصص یافته سلول های شکمی کاهش می یابد. شاید پدیده مهم برای تعیین محور حرکت ممانعت کننده Gsk3 به سیتوپلاسم مقابل نقطه ای که اسپرم وارد می شود باشد. (یعنی به طرف سلول پشتی آینده).یک کاندید برای این عامل پروتئین Disheveled است.این پروتئین ممانعت کننده طبیعی از Gsk3 در مسیرWnt است .شکل (23-6)واین پروتئین ابتدا در قشر نباتی تخم زنوپوس لقاح نیافته کشف شده است .به هر حال در لقاح به پروتئین Disheveled انتقال یافته همراه میکروتوبول های نظم یافته در سمت پشتی جنین وابسته است. بنابراین روی طرف پشتی بتا کتنین باید ثابت باشد زیرا Gsk3 نمی تواند آن را کاهش دهد.ولی درسمت شکمی جنین Gsk3 باید کاهش بتا کتنین را آغاز کند.(بتا کتنین تجزیه می شود.)بتا کتنین به عنوان عامل رونویسی می تواند به عوامل رونویسی دیگر پیوسته وخصوصیات جدیدی به آنها بدهد. بتا کتنین زنوپوس می تواند با عامل رونویسی فراگیری که به عنوان Tcf3 شناخته می شود ترکیب شود. شکل جهش یافته که فاقد ناحیه ی متصل شونده به بتا کتنین است باعث می شود جنین هایی فاقد ساختار پشتی به وجود آیند .کمپلکسB-catenin / Tcf3 به پروموتور چندین ژن که نقش مهمی در تشکیل محور دارندمتصل می شودsiamois. یکی از ژنها یی است که در مرکز نیوکوپ بلافاصله به دنبال مرحله گذار بلاستولای میانی بیان می شوند.اگر این ژن به طور نابجا در سلول های نباتی شکمی بیان می شوند یک محور ثانویه روی طرف شکمی قبلی جنین پدیدار می شود. و اگر از چرخش قشری جلوگیری شود siamois حذف می شود.به نظر می رسد که پروتئین Tcf3در غیاب بتا کتنین به راه انداز siamois متصل شده ورونویسی آن را متوقف می کند.به هر حال وقتی که
کمپلکسB-catenin / Tcf3 به پروموتور متصل می شود ، siamoisفعال می شود. پروتئین های siamois برای بیان ژنهای ویژه سازمان دهنده ضروری می باشند. پروتئین های siamois به پروموتور ژن goosecoid متصل می شودو بیان آن رافعال می کند به نظر می رسد پروتئینgoosecoid برای فعالیت چندین ژن در سازمان دهنده های اسپمان(تخصصی شدن مزودرم پشتی ) ضروری است.بنابراین می توان انتظار داشت که طرف پشتی جنین حاوی بتا کتنین است ،که بتا کتنین اجازه بیان ژن siamois را داده وبیان این ژن تشکیل سازمان دهند ها را به راه می اندازد.اما siamois به تنهایی برای تولید سازمان دهنده ها کافی نبوده وبه نظر می رسد پروتئین دیگری نیز در فعال کردن ژنgoosecoid وتشکیل سازمان دهنده ضروری است .مطالعات اخیر پیشنهاد می کند که حداکثر بیان goosecoid زمانی رخ می دهد که بین پروتئینsiamois و بیان سیگنال TGF-βاز سلول های نباتی همزمان باشد. هنگام چرخش قشر شاید بتا کتنین فعال شود و اجازه می دهد siamois در ناحیه ی پشتی جنین بیان شود .انتقال پیام مشخص رمز گذاری یک فاکتور از خانواده TGF-β شاید تولید پروتئین راآغاز می کندکه بیشترین فعالیت goosecoid در سلول هایی که تبدیل به سازمان دهنده می شود را تحریک کند. خانواده پروتئین TGF-β در مرکز نیوکوپ می تواند سلول های ناحیه پشتی بالایی را برای بیان عوامل رونویسی که به پروموتور ژن goosecoid متصل می شود را القا کند و برای فعال کردن این ژن با پروتئین siamois همکاری می کند. کاندیدی برای القا فاکتور TGF-βپروتئین وابسته به vg1,vegT,Nodal است که هریک از این پروتئین ها در آندودرم ساخته می شوند. آگوست وهمکارانش نشان دادند که همه ی این پروتئین ها شاید در این مسیر عمل کننداما پروتئین های بحرانی در تخصصی شدن مزودرم فاکتور های وابسته به Nodal هستند.وقتی آنها تجربیات نوترکیبی حیوانی –نباتی نیوکوپ را درحالی که مهارکننده ویژه ای از پروتئین وابسته به Nodal را به کار می بردند تکرارکردند مشاهده کردندکه عمل القا کننده سلول های نباتی ازبین می رود. (البته این مهار کننده vg1,vegTواکتیوین راغیر فعال کرد).در حالی که درجریان مرحله نهایی بلاستولا سه پروتئین وابسته بهNodal شاملXnr1,Xnr2,Xnr3 که بایک شیب پشتی – شکمی در آندودرم بیان می شوند.این شیب توسط بیان ژن وابسته به نودال زنوپوس که دراثر همکاری vg1,vegTبابتاکتنین فعال می شود ، ایجاد می گردد. آگوست وهمکارانش مدلی ارائه کردند. در این مدل پیام های بتا کتنین که درناحیه پشتی قرار گرفته وپیام vg1 که در ناحیه نباتی قرار گرفته اندبرای ایجاد شیبی از پروتئین وابسته بهNodal شاملXnr1,Xnr2,Xnr3)) در سر تاسر آندودرم با یکدیگر بر همکنش دارند.این پروتئین وابسته به Nodal در تخصص یافتگی مزودرمی نقش دارند. مناطقی که داری مقداربسیارکمی از این پروتئین ها هستندیا اصلا ندارند به مزودرم شکمی تبدیل شدند، مناطقی که دارای مقدار بیشتری بودند به مزودرم جانبی تبدیل شدند،و سرانجام مناطقی که دارای مقادیر خیلی بالا بودند به سازمان دهنده تبدیل می گردند. این پروتئین های وابسته به نودال، ژن goosecoid را فعال خواهد کرد و ممانعت کننده های تخصصی پروتئین وابسته به نودال مانع این فعالیت می شوند.
اعمال سازمان دهنده ها :
در حالی که سلول های مرکز نیوکوپ آندودرمی باقی می مانند،سلول های سازمان دهنده تبدیل به مزودرم پشتی شده و زیر اکتودرم مهاجرت می کنند. این مزودم پشتی تشکیل سیستم عصبی مرکزی را القا می کند. خصو صیات بافت سازمان دهنده را می توان به پنج عمل اصلی تقسیم کرد:
1- توانایی تمایز خود بخودی مزودرم پشتی(صفحه پری کوردال – مزودم نوتوکورد و غیره)
2- توانایی پشتی کنندگی مزودرم اطراف و ایجاد مزودرم مجاور مزودم جانبی (در صورتی که طرف دیگر مزودرم شکمی تشکیل می دهند)
3- توانایی پشتی کنندگی اکتودرم درمجاور اکتودرم عصبی.
4- توانایی به کاراندازی حرکات گاسترولاسیون
5- توانایی ایجاد صفحه عصبی (القا اکتودرم عصبی ) به لوله عصبی.
در زنوپوس و دیگر مهره داران تشکیل محور قدامی – خلفی به دنبال تشکیل محور پشتی – شکمی است.به محض این که بخش پشتی جنین تثبیت می شود ، حرکت درون خزیدگی مزدرم، محور قدامی - خلفی راتثبیت می کند. مزودرمی که درابتدا از بالای لبه پشتی بلاستو پور مهاجرت می کند ساختار های قدامی را ایجاد می کند و مزودرمی که از بالای لبه شکمی وجانبی مهاجرت می کند ساختار های خلفی را ایجاد می کند. در حال حاضر عقیده بر این است که سلول های سازمان دهنده نهایتا درتشکیل 4 نوع سلول یعنی آندودرم حلقی، مزودرم سری(صفحه پری کوردال)،مزدرم پشتی عمدتا نوتوکورد و لبه پشتی بلاستوپور شرکت می کنند. آندودرم حلقی وصفحه پری کوردال روند مهاجرت بافت سازمان دهنده را هدایت کرده و مغز قدامی و میانی رالقا می کند. مزودرم پشتی نیز مغز خلفی وتنه را القا می کند .لبه پشتی بلاستوپور مزودرم پشتی راتشکیل می دهد و نهایتا به محور کوردانورال تبدیل می شود ،که راس دم را القا می کند.
بنابر این ،فعال شدن چندین ژن باعث تشکیل مزودرم پشتی می شود. تصور می شود که پروتئین های مترشحه از مرکز نیوکوپ مجموعه ای از عوامل رونویسی رادر سلول های مزودرمی فعال می کند. این عوامل رونویسی نیز ژن های کد کننده مولکول های مترشحه از سازمان دهنده را فعال می سازد. تا کنون چندین عامل رونویسی ویژه ی سازمان دهنده شناسایی گردیده که در جدول زیر لیست شده است.
